Pannel ứng dụng trong chẩn đoán Thalassemia

Tổng quan Thalassemia

Giới thiệu Thalassemia

Thalassemia (hay còn được gọi với tên bệnh tan máu bẩm sinh) là một bệnh lý huyết học di truyền có tỷ lệ lưu hành cao trên toàn cầu và là một vấn đề y tế công cộng quan trọng, đặc biệt ở các vùng lưu hành bệnh như Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Trung Đông và Châu Phi.¹ Nguyên nhân cốt lõi gây ra bệnh Thalassemia nằm ở sự bất thường trong quá trình tổng hợp hemoglobin – một loại protein phức tạp có trong tế bào hồng cầu, đóng vai trò vận chuyển oxy đi khắp cơ thể.

Ở người trưởng thành hemoglobin được cấu tạo từ hai chuỗi alpha (α) globin và hai chuỗi beta (β) globin. Sự tổng hợp các chuỗi globin này được kiểm soát bởi các gene nằm trên nhiễm sắc thể, cụ thể như sau:

• Gene α globin: Nằm trên nhiễm sắc thể số 16 (gene HBA1 và HBA2). Mỗi người có bốn gene α globin (hai gene từ bố và hai gene từ mẹ).
• Gene β globin: Nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (gene HBB). Mỗi người có hai gene β globin (một gene từ bố và một gene từ mẹ).

Đột biến hoặc mất đoạn ở một hoặc nhiều gene này sẽ dẫn đến giảm hoặc không sản xuất được chuỗi globin tương ứng, gây ra bệnh Thalassemia.

Cơ chế sinh bệnh và phân loại bệnh của Thalassemia

Cơ chế bệnh sinh cốt lõi của Thalassemia là sự mất cân bằng, trong việc sản xuất chuỗi α-globin và β-globin. Sự mất cân bằng này dẫn đến tình trạng tạo hồng cầu không hiệu quả (ineffective erythropoiesis), tan máu (hemolysis), thiếu máu mạn tính và các biến chứng liên quan như quá tải sắt và biến dạng xương.¹

Nguyên nhân cốt lõi của quá trình mất cân bằng này là do đột biến hoặc mất đoạn gen quy định tổng hợp chuỗi alpha (α) globin hoặc chuỗi beta (β) globin.  Do đó, Bệnh Thalassemia chủ yếu được phân loại thành 2 loại chính là: α-thalassemia và β-thalassemia.¹ Cụ thể như sau:

β-thalassemia: sự thiếu hụt chuỗi β-globin dẫn đến dư thừa chuỗi α-globin. Các chuỗi α-globin dư thừa này không hòa tan, kết tủa trong các tiền thân hồng cầu, gây ra hiện tượng chết tế bào theo chương trình (apotosis) và tạo hồng cầu không hiệu quả.¹

Đối với α-thalassemia: sự thiếu hụt chuỗi α-globin dẫn đến dư thừa các chuỗi không phải α (γ trong đời sống bào thai và β sau sinh), hình thành các tetramer bất thường như Hb Bart’s (γ4) và HbH (β4).¹

Mức độ biểu hiện của Thalassemia

Mức độ biểu hiện (mức độ nghiêm trọng) của bệnh thalassemia chủ yếu phụ thuộc vào số lượng và loại gen globin bị đột biến, cũng như bản chất của đột biến đó. Nhìn chung, có nhiều loại đột biến có thể xảy ra trong Thalamessia nhưng chủ yếu được chia thành 2 nhóm đột biến bao gồm: (1) Đột biến mất đoạn và (2) Đột biến điểm.

Trong đó:

(1) Đột biến mất đoạn là loại đột biến phổ biến, đặc biệt trong  α-Thalassemia. Các đột biến này liên quan đến việc mất một đoạn của gen hoặc toàn bộ gen, dẫn đến không sản xuất được hoặc giảm sản xuất chuỗi globin tương ứng.

Trong α-Thalassemia: Mức độ nghiêm trọng phụ thuộc vào loại đột biến và số lượng gen α-globin bị đột biến (trong tổng số 4 gen alpha globin) như bảng và hình mình họa dưới đây.

Bảng 1. Các mức độ biểu hiện của bệnh α-Thalassemia

Số lượng gene α-globin bị đột biến hoặc mất	Kiểu gene	Triệu chứng lâm sàng
Không đột biến	αα/αα	Người bình thường
Đột biến hoặc mất 1 gene α-globin	αα/α- (αα/αα0)	Thường không có triệu chứng (người mang gen thường gọi là Carrier
Đột biến hoặc mất 2 gene α-globin	α-/α- (αα0/αα0) hoặc αα/– (αα/α0α0)	Gây bệnh α – Thalassemia thể nhẹ, thiếu máu nhẹ
Đột biến hoặc mất 3 gene α-globin	α-/– (aa0/a0a0)	Gây bệnh Hemoglobin H (HbH), mức độ từ trung bình đến nặng.
Đột biến hoặc mất 4 gene α-globin	–/–	Gây hội chứng Hb Bart’s (còn được gọi là hội chứng phù thai nhi Hb Bart’s) dạng rất nặng, thường gây tử vong cho thai nhi hoặc trẻ sơ sinh.

Ghi chú: α⁰ (α-zero): Các đột biến thuộc loại a⁰ dẫn đến việc hoàn toàn không sản xuất được α chuỗi  globin từ gen bị đột biến đó. Từ “zero” ở đây ám chỉ “không có sản phẩm chuỗi α.

(2) Đột biến điểm: Là sự thay đổi một cặp base duy nhất trong trình tự DNA của gen. Đột biến điểm có thể ảnh hưởng đến quá trình sao mã, dịch mã, hoặc sự ổn định của mRNA hoặc protein globin. Đây là loại đột biến chính gây ra β-Thalassemia và cũng có thể gặp trong α-Thalassemia.

β-Thalassemia: Mức độ nghiêm trọng phụ thuộc vào việc cả hai gene β-globin có bị đột biến hay không và loại đột biến mắc phải như là: đột biến gây giảm sản xuất chuỗi β globin (thường được kí hiệu là β⁺), hay đột biến gây ngừng hoàn toàn sản xuất chuỗi β globin (thường được ký hiệu là β⁰).

Bảng 2. Các mức độ biểu hiện của bệnh β-Thalassemia

Số lượng gene α-globin bị đột biến hoặc mất	Kiểu gene	Triệu chứng lâm sàng
Không đột biến	β/β	Người bình thường
Đột biến hoặc mất 1 gene β -globin	β/β0 hoặc β/β+	β-Thalassemia thể ẩn (người mang gen), ít hoặc không có triệu chứng.
Đột biến 1 gene và mất 1 gene β -globin hoặc đột biến 2 gene	β+/β+  hoặc β+/β0	Gây β-Thalassemia thể trung gian, mức độ thiếu máu và triệu chứng đa dạng.
Mất 2 gene β -globin	β0/β0	β-Thalassemia thể nặng (còn gọi là bệnh Cooley), cần truyền máu thường xuyên.

Các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán Thalassemia

Hiện nay, bệnh thalassemia chủ yếu được sàng lọc và chẩn đoán thông qua các xét nghiệm máu, trong đó bao gồm các xét nghiệm phổ biến như sau:

Phương pháp tổng phân tích tế bào máu

Tổng phân tích tế bào máu là phương pháp xét nghiệm đầu tiên được chỉ định của bộ y tế giúp phát hiện các dấu hiệu bất thường của hồng cầu như số lượng hồng cầu giảm, kích thước hồng cầu nhỏ (MCV thấp), lượng huyết sắc tố trung bình trong một hồng cầu thấp (MCH thấp). Ngoài ra phương pháp tổng phân tích tế bào máu có thể phát hiện các hình thái hồng cầu bất thường như anisopoikilocytosis (hồng cầu đa kích thước, đa hình dạng), hồng cầu hình bia, hồng cầu nhân, hạt ưa base, và thể vùi HbH (hình ảnh quả bóng golf).¹ Những chỉ số này gợi ý tình trạng thiếu máu và có thể là dấu hiệu của Thalassemia.

Xét nghiệm sắt huyết thanh (ferritin, độ bão hòa transferrin) là bước không thể thiếu để loại trừ IDA, một chẩn đoán phân biệt quan trọng của thiếu máu hồng cầu nhỏ.¹ Việc sử dụng thường quy các xét nghiệm sắt để phân biệt Thalassemia với IDA không chỉ là một bước chẩn đoán mà còn là một yếu tố sàng lọc quan trọng cho các xét nghiệm phân tử tốn kém hơn. Chẩn đoán sai ở giai đoạn này có thể dẫn đến việc thực hiện các xét nghiệm gene không cần thiết hoặc ngược lại, bỏ sót chẩn đoán Thalassemia.⁶

Điện di huyết sắc tố

Điện di huyết sắc tố cũng là một phương pháp xét nghiệm máu giúp phân tích và định lượng các thành phần của hemoglobin để từ đó xác định các thành phần hemoglobin là bình thường hay là bất thường. Điện di huyết sắc tố bao gồm các kỹ thuật điện di như:

 Điện di hemoglobin trên môi trường cellulose acetate, citrate agar, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường dùng để định lượng HbA, HbA2, HbF và phát hiện các biến thể như HbH, Hb Bart’s.¹ Điện di mao quản (CE) cũng được sử dụng như một phương pháp thay thế hoặc bổ sung.¹²

Tuy nhiên, các 2 phương pháp kế trên có những hạn chế nhất định, chẳng hạn như không thể phát hiện tất cả các trạng thái mang gene (đặc biệt là α-thalassemia thể ẩn), gặp khó khăn trong việc giải quyết các trường hợp phức tạp/không điển hình và không cung cấp đặc điểm phân tử chính xác.¹² Những hạn chế này đã được cải thiện bằng sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử.

Phương pháp sàng lọc và chẩn đoán Thalassemia phân tử

Sự ra đời của chẩn đoán phân tử đã đáp ứng nhu cầu xác định gene bệnh một cách chính xác, nhận diện người mang gene, chẩn đoán trước sinh (PND) và chẩn đoán di truyền trước làm tổ (PGD).¹² Các kỹ thuật phân tử được nghiên cứu ban đầu bao gồm giải trình tự Sanger cho đột biến điểm, Gap-PCR cho các đột biến mất đoạn phổ biến, Reverse Dot Blot (RDB) cho các đột biến đã biết và Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) cho các đột biến mất/lặp đoạn.⁶

Sự phức tạp và tính không đồng nhất về mặt di truyền của Thalassemia sau đó đã thúc đẩy sự chuyển đổi từ các xét nghiệm phân tử đơn gene sang các panel xét nghiệm đa gene.¹² Sự phát triển của các phương pháp chẩn đoán này phản ánh một xu hướng rộng lớn hơn trong di truyền y học hướng tới các chẩn đoán toàn diện hơn, được xác định ở cấp độ phân tử, thay vì các phân loại thuần túy dựa trên kiểu hình.

Bảng 3. So sánh các phương pháp chẩn đoán Thalassemia truyền thống, phân tử và panel.

Đặc điểm	Phương pháp truyền thống (CBC, Phết máu, Phân tích Hb)	Chẩn đoán phân tử (Sanger, Gap-PCR)	Panel xét nghiệm (NGS)
Phương pháp luận	Huyết học, sinh hóa	PCR, giải trình tự	Giải trình tự song song hàng loạt, bắt giữ mục tiêu
Phạm vi	Sàng lọc ban đầu, gợi ý chẩn đoán	Phát hiện đột biến/mất đoạn đã biết	Phân tích đồng thời nhiều gene, phát hiện đột biến mới
Phát hiện đột biến	Gián tiếp qua thay đổi huyết học/Hb	Trực tiếp, giới hạn ở mục tiêu cụ thể	Toàn diện (SNV, indel, CNV tiềm năng)
Phát hiện người mang gene	Hạn chế, bỏ sót thể ẩn	Tốt hơn, nhưng vẫn giới hạn	Độ nhạy cao, đặc biệt với α-thalassemia
Khả năng PND/PGD	Không trực tiếp	Có thể, nếu đột biến gia đình đã biết	Lý tưởng, độ chính xác cao
Chi phí (tương đối)	Thấp	Trung bình	Cao
Thời gian trả kết quả	Nhanh	Vài ngày đến vài tuần	Vài ngày đến vài tuần, tùy thuộc vào quy trình
Hạn chế	Độ nhạy/đặc hiệu hạn chế, không xác định đột biến	Bỏ sót đột biến mới/hiếm, mất đoạn lớn	VUS, thách thức tin sinh học, chi phí ở một số nơi

Chú thích: NGS (Giải trình tự thế hệ mới), SNV (Biến thể đơn nucleotide), Indel (Chèn/mất đoạn nhỏ), CNV (Biến thể số lượng bản sao), SV (Biến thể cấu trúc), VUS (Biến thể chưa rõ ý nghĩa lâm sàng).

Các công nghệ được sử dụng trong panel gene Thalassemia

Panel gene chẩn đoán được định nghĩa là các xét nghiệm cho phép phân tích đồng thời nhiều gene liên quan đến một kiểu hình cụ thể hoặc một nhóm các rối loạn có liên quan.²⁹ Phương pháp này đặc biệt hữu ích cho các bệnh không đồng nhất về mặt di truyền như Thalassemia.³¹

Mục tiêu phân tử trong panel Thalassemia

Các panel chẩn đoán Thalassemia thường nhắm vào các gene sau:

• Cụm gene α-globin (HBA1, HBA2 trên nhiễm sắc thể 16): Phát hiện các đột biến mất đoạn (ví dụ: -α3.7, -α4.2, –SEA, –MED, –FIL, –THAI, -(α)20.5), lặp đoạn (ví dụ: αααanti−3.7), và đột biến điểm (ví dụ: Hb Constant Spring (HBA2:c.427T>C), Hb Quong Sze, Hb Adana).¹
• Cụm gene β-globin (HBB trên nhiễm sắc thể 11): Phát hiện các đột biến điểm (đột biến vùng promoter, vị trí nối ghép (splice site), vùng mã hóa dẫn đến các alen β0, β+, β++), các đột biến chèn/mất đoạn nhỏ (indel), và các đột biến mất đoạn hiếm gặp.¹
• Gene delta-globin (HBD): Thường được bao gồm để giải thích mức HbA2 và chẩn đoán δβ-thalassemia hoặc δ-thalassemia, những tình trạng có thể làm phức tạp việc chẩn đoán β-thalassemia.⁸
• Gene gamma-globin (HBG1, HBG2): Liên quan đến Tồn tại dai dẳng Hemoglobin bào thai (HPFH) và hiểu biết về mức HbF, một yếu tố điều hòa quan trọng mức độ nặng của β-thalassemia.⁸

Sự phát triển của nội dung panel từ việc chỉ tập trung vào các gene HBA và HBB ⁵ sang bao gồm cả HBD, HBG1/HBG2 ¹³ và thậm chí cả các gene điều hòa không phải globin phản ánh sự hiểu biết sâu sắc hơn về tính phức tạp di truyền của Thalassemia và những hạn chế của việc tập trung chẩn đoán hẹp. Xu hướng này được thúc đẩy bởi nhu cầu giải thích sự thay đổi kiểu hình và giải quyết các trường hợp không rõ ràng.

Các công nghệ được sử dụng trong panel Thalassemia

Công nghệ dựa trên PCR (Polymerase Chain Reaction)

Multiplex PCR: Cho phép khuếch đại đồng thời nhiều đoạn gen đích khác nhau trong một phản ứng duy nhất. Điều này giúp phát hiện nhiều đột biến điểm hoặc các đoạn gen nhỏ một cách hiệu quả.

ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR) hoặc Allele-Specific PCR: Sử dụng các mồi đặc hiệu để phát hiện các đột biến điểm đã biết. Nhiều xét nghiệm ARMS có thể được gộp lại (multiplex ARMS-PCR) để sàng lọc đồng thời nhiều đột biến phổ biến.

Gap-PCR: Được thiết kế đặc biệt để phát hiện các đột biến mất đoạn (deletions) thường gặp trong Alpha Thalassemia (ví dụ: –SEA, -α3.7, -α4.2) và một số đột biến mất đoạn hiếm hơn trong Beta Thalassemia. Panel có thể bao gồm nhiều cặp mồi Gap-PCR khác nhau để phát hiện các loại mất đoạn khác nhau.

Real-time PCR kết hợp với phân tích đường cong nóng chảy (High-Resolution Melting – HRM): Có thể được sử dụng để sàng lọc các biến thể trình tự (bao gồm cả đột biến điểm mới) dựa trên sự khác biệt về nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR.

Công nghệ Lai (Hybridization)

Reverse Dot Blot (hoặc Line Probe Assay): Sản phẩm PCR được lai với các đầu dò (probe) đặc hiệu cho các đột biến đã biết được cố định trên một màng lai (strip). Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời hàng chục đột biến điểm và mất đoạn nhỏ phổ biến. Ví dụ như các bộ kit “StripAssay”.

DNA Microarray (Chip y tế): Cho phép phân tích đồng thời hàng trăm đến hàng ngàn đột biến gen trên một chip nhỏ. Các đầu dò DNA được gắn trên bề mặt chip sẽ lai với DNA của bệnh nhân. Mặc dù có tiềm năng lớn, việc ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán Thalassemia thường quy có thể bị hạn chế bởi chi phí và sự phức tạp.

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

Công nghệ này rất hiệu quả để phát hiện các thay đổi số lượng bản sao gen (Copy Number Variations – CNVs), tức là các đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn.

Trong panel Thalassemia, MLPA đóng vai trò quan trọng trong việc xác định các đột biến mất đoạn lớn trên gen alpha-globin (nguyên nhân chính của Alpha Thalassemia) và các đột biến mất đoạn/lặp đoạn hiếm gặp hơn trên gen beta-globin mà các phương pháp PCR thông thường có thể bỏ sót.

Giải trình tự gen (Sequencing)

Giải trình tự Sanger: Thường được sử dụng để xác nhận các đột biến được phát hiện bằng các phương pháp khác hoặc để phân tích các vùng gen cụ thể không được bao phủ đầy đủ bởi các panel sàng lọc ban đầu, đặc biệt khi nghi ngờ đột biến hiếm hoặc mới. Một số panel có thể tích hợp giải trình tự Sanger cho các exon quan trọng của gen HBB.

Giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing – NGS): Đây là công nghệ mạnh mẽ và ngày càng phổ biến trong các panel Thalassemia toàn diện.

Targeted Gene Panels (Panel gen đích): NGS cho phép giải trình tự đồng thời toàn bộ vùng mã hóa (exon), các vùng intron quan trọng (nơi có thể chứa đột biến ảnh hưởng đến splicing) và cả các vùng điều hòa của các gen globin (HBA1, HBA2, HBB) và đôi khi cả các gen liên quan khác.

Ưu điểm của NGS trong panel Thalassemia bao gồm:

(1) Khả năng phát hiện phổ rộng các loại đột biến: đột biến điểm, đột biến chèn/mất đoạn nhỏ (indel), và với các thuật toán phân tích phù hợp, có thể phát hiện cả các biến thể số lượng bản sao (CNVs).

(2) Phát hiện được các đột biến hiếm gặp và đột biến mới mà các phương pháp dựa trên phát hiện đột biến đã biết có thể bỏ sót.

(3) Hiệu quả về chi phí khi cần phân tích toàn diện nhiều vùng gen.

(4) Các nền tảng NGS phổ biến bao gồm Illumina, Ion Torrent.

tài liệu tham khảo

1. Muncie, H. L., Jr., & Campbell, J. (2009). Thalassemias: An overview. American Family Physician, 80(4), 339–344.
2. Sutar, P., Das, S., Jena, L., & Dehury, S. (2024). Thalassemia: Pathophysiology, diagnosis, and advances in treatment
3. Cleveland Clinic. (2022, May 16). Beta thalassemia: Types, symptoms & treatment.
4. PreventionGenetics. (2024, March 25). Alpha Thalassemia Panel Test.
5. Piel, F. B., & Weatherall, D. J. (2024). Diagnosis and treatment of alpha thalassemia major. Hematology/Oncology Clinics of North America, 38(4), 717-733.
6. Cao, A., & Kan, Y. W. (2013, January 3). Beta-Thalassemia. In M. P. Adam, G. M. Mirzaa, R. A. Pagon, S. E. Wallace, L. J. H. Bean, K. W. Gripp, & A. Amemiya (Eds.), GeneReviews®. National Center for Biotechnology Information (US).
7. Shang, X., & Xu, X. (2021). The evolving role of next-generation sequencing in screening and diagnosis of hemoglobinopathies. Frontiers in Physiology, 12, 686689.
8. Sharma, N., Dadu, T., & Ranamalla, P. (2014). Prevalence of alpha thalassemia in microcytic anemia: A tertiary care experience from North India. Indian Journal of Hematology & Blood Transfusion, 30(Suppl 1), 231–234.
9. Crockett, M., Cross, S., Hwu, W.-L., & Lin, S.-P. (2024). Clinical utility of the addition of molecular genetic testing to newborn screening for hemoglobinopathies for confirmation of alpha-thalassemia trait. Genes, 15(1), 12.
10. Cao, A., & Kan, Y. W. (2013). Beta-Thalassemia. In M. P. Adam et al. (Eds.), GeneReviews®.
11. Chippagiri, S., & Gillellamudi, S. B. (2024, January 10). Laboratory evaluation of alpha thalassemia. In StatPearls.
12. Giardine, B., & Mast, A. (2020). Update in laboratory diagnosis of thalassemia. Frontiers in Molecular Biosciences, 7, 74.
13. Waye, J. S., & Eng, B. (2023, August 28). Laboratory evaluation of beta thalassemia. In StatPearls.
14. Shang, X., & Xu, X. (2021). The evolving role of next-generation sequencing in screening and diagnosis of hemoglobinopathies. Frontiers in Physiology, 12, 686689.
15. He, S., Li, Y., Mai, Z., Liang, Z., Mai, H., Chen, Z., Fu, X., Lin, F., Li, H., Chen, S., Mo, Q., Liu, Z., Li, D., & Jin, L. (2022). Applications of next generation sequencing in the screening and diagnosis of thalassemia. Orphanet Journal of Rare Diseases, 17(1), 385.
16. Point32Health. (2024, January). Genetic testing – Prenatal diagnosis and carrier screening.
17. Thein, S. L. (2013). The molecular basis of β-thalassemia. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 3(5), a011700.
18. Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust. (n.d.). Genetic testing for haemoglobinopathies (R93, R94, R361, R362).
19. Centers for Disease Control and Prevention. (2024, March 28). Genetic testing. Genomics and Your Health.
20. Forget, B. G., & Bunn, H. F. (2013). HbA2 levels in normal adults are influenced by two distinct genetic mechanisms. Blood, 121(12), 2181-2182.
21. Danjou, F., Francavilla, M., Anni, F., Satta, S., Vania, A., Manunza, L., … & Cao, A. (2012). Genetic modifiers of β-thalassemia and clinical severity as assessed by a LOHAS score. Haematologica, 97(7), 999–1005.
22. Zhao, Y., Liu, H., Zhao, H., Zhang, L., Cheng, L., & Luo, S. (2023). Application of next generation sequencing in thalassemia screening: A systematic review and meta-analysis. Heliyon, 9(2), e13361.
23. Al Zahrani, M., & Aljurf, M. (2023). A genomic perspective of benign hematological disorders in the era of next-generation sequencing. Journal of Hematology & Allied Sciences, 3(1), 1-11.
24. Li, W., Wang, S., Li, J., & Zhang, J. (2024). Comparison of next-generation sequencing and Oxford nanopore technology for noninvasive prenatal testing in thalassemia screening: A comprehensive review. Clinica Chimica Acta, 557, 118872.
25. Alfano, G., Miscione, H., Melchionda, O., Guacci, A., Pernechele, G., Frangella, M., … & Palumbo, O. (2024). Nanopore long-read sequencing as a first-tier diagnostic test to detect repeat expansions in neurological disorders.
26. He, J., Chen, G., Ou, T., Xiao, B., Zhong, L., Li, C., … & Xu, M. (2024). Haplotype-resolved genotyping and association analysis of 1020 β-thalassemia patients by targeted long-read sequencing. Human Genetics, 143(6), 805-817.
27. He, S., & Xu, X. (2023). Next-generation sequencing (NGS) and third-generation sequencing (TGS) for the diagnosis of thalassemia. Diagnostics, 13(3), 373.
28. Lee, S. M., Kim, Y., Kang, H. J., Lee, H. S., Kim, J. K., & Lee, K. E. (2024). Diagnostic performance of next-generation sequencing (NGS) in indeterminate thyroid nodules: A single hospital experience. International Journal of Molecular Sciences, 26(9), 4225.
29. Locatelli, F., Porter, J., El-Beshlawy, A., Li, C. K., Chan, L. L., Tifu, C., … & Viprakasit, V. (2019). Current and future alternative therapies for beta-thalassemia major. Expert Opinion on Orphan Drugs, 7(3), 113-126.
30. Singh, S., Srivastav, S., Singh, A. K., Singh, A., Singh, K., & Singh, V. K. (2020). Impact of genetic polymorphisms in modifier genes in determining fetal hemoglobin levels in beta-thalassemia. Journal of Clinical Laboratory Analysis, 34(1), e23019.
31. Luo, H. Y., Nalam, S., & ClinGen Hemoglobinopathy Variant Curation Expert Panel. (2021). Adapting the ACMG/AMP variant classification framework: A perspective from the ClinGen Hemoglobinopathy Variant Curation Expert Panel. Human Mutation, 42(12), 1467–1476.
32. Nakao, T., Shimokawa, T., Koh, Y., Nawa, T., Morita, A., & Yonemori, K. (2024). Cost-effectiveness analysis of the Oncomine™ Dx Target Test MultiCDx System using next-generation sequencing and single-gene test in advanced and recurrent nonsquamous non-small-cell lung cancer. JMA Journal, 7(2), 131-141.
33. World Health Organization. (n.d.-a). Diagnosis, management and prevention of thalassaemia. Retrieved May 8, 2025, from https://www.who.int/teams/noncommunicable-diseases/genetic-disorders/thalassaemia/diagnosis-management-prevention
34. Shang, X., & He, S. (2022). Molecular mechanisms and diagnostic methods for hemoglobinopathies. Biomolecules, 12(11), 1809.