Sự liên kết của các enzyme, đặc biệt giữa alkaline phosphatase và horseradish peroxidase với oligo đóng vai trò quan trọng trong quá trình nghiên cứu, sản xuất trong chẩn đoán probe. Điều này cùng với sự quan tâm trong đánh dấu các nhãn đặc thù cho thiol (thiol-specific tag) góp phần đưa ra các ý tưởng nghiên cứu về phương pháp sản xuất oligonucleotide biến đổi thiol (Thiol-modified oligonucleotide) trong nghiên cứu.
Nhóm Thiol biến đổi (Thiol-modifier) trong sản xuất các nhóm sulfhydryl ở vị trí 5′-terminus được ứng dụng dựa trên việc khóa nhóm thiol bằng nhóm bảo vệ trityl trong quá trình tổng hợp. Mặc dù quy trình này đã được sử dụng thành công nhưng vẫn tồn tại một số vấn đề, như mức độ khử DMT (Oxidative detritylation) thấp trong quá trình tổng hợp và sử dụng bạc nitrate trong bước khử bảo vệ cuối cùng.
Bài nghiên cứu của A. Kumar đề cập đến việc dùng N-acetyl-DL-homocystein thiolactone để điều chỉnh một 5′-amino-oligonucleotide thành một thiol. Thiol-modified oligonucleotide tại vị trí 3′-thiols được tổng hợp dựa trên các giá đỡ thể rắn (solid support) chứa liên kết disulfide. Những oligonucleotide này biến đổi thiol ở vị trí 3′ đặc biệt hữu ích khi muốn sử dụng một loại đánh dấu khác cho vị trí đầu 5′ của chúng.
(Nguồn: Glen Research)
1. Nhóm Thiol tại Vị trí 5′-Terminus
a) Tổng hợp DMT-OFF
Thiol-Modifier C6 S-S được thêm vào vị trí đầu 5′ của oligonucleotide bằng phương pháp tổng hợp tự động DMT-OFF. Việc giải phóng DMT từ chu kỳ cuối có thể dùng để xác định hiệu suất ghép nối. Đối với ammonium hydroxide tiêu chuẩn được sử dụng để khử bảo vệ, dithiothreitol (DTT) được thêm vào để đạt nồng độ 0,05M. Tiến hành quá trình khử bảo vệ (55°C/16h). Quy trình này sẽ giúp loại bỏ các nhóm bảo vệ base và làm đứt gãy liên kết disulfide để tạo ra gốc 5′-thiol. Sau đó, các bước ly tâm, loại bỏ muối, và tinh sạch oligonucleotide biến đổi thiol được thực hiện dựa trên các quy trình tiêu chuẩn (nếu cần).
b) Tổng hợp DMT-ON
Thiol-Modifier C6 S-S được thêm vào vị trí 5′-terminus của oligonucleotide bằng phương pháp tổng hợp tự động DMT-ON. Tiến hành quá trình khử bảo vệ theo cách thông thường. Quá trình tinh sạch trityl trong oligonucleotide dùng phương pháp tinh sạch bằng HPLC hoặc trên cartridge. Sau đó, tiến hành bay hơi dung dịch sản phẩm cho đến khi khô. Sử dụng DTT (0,04M trong dung dịch phosphate 0,17M, pH 8) trong 16 giờ để cắt liên kết disulfide. Sau đó, khử muối trong oligonucleotide bằng phương pháp cartridge hoặc cột. (Thiol chứa DMT sẽ vẫn gắn với matrix loại bỏ muối.)
2. Nhóm Thiol tại vị trí 3′-Terminus trong oligonucleotide
Thiol-Modifier C6 S-S được thêm vào bất kỳ giá đỡ nucleoside nào hoặc sử dụng Thiol-Modifier C3 S-S CPG để tổng hợp oligonucleotide mong muốn. Đối với ammonium hydroxide tiêu chuẩn được sử dụng để giải bảo vệ, dithiothreitol (DTT) được thêm vào để đạt được nồng độ 0,05M. Sau đó, tiến hành quá trình khử bảo vệ ở 55°C trong 16 giờ. Quy trình này giúp loại bỏ các nhóm bảo vệ base và làm đứt gãy liên kết disulfide để tạo ra gốc 3′-thiol. Sau đó, các bước ly tâm, loại bỏ muối, và tinh sạch thiol-modified oligonucleotide được thực hiện dựa trên các quy trình tiêu chuẩn (nếu cần).
Lưu ý: Thiol-modified oligonucleotide nên được bảo quản trong môi trường bất hoạt hoặc trong dung dịch chứa DTT (0,01M) để tránh tạo thành liên kết disulfide do quá trình oxi hóa. Nếu cần thiết, DTT có thể được trích xuất từ dung dịch bằng ethyl acetate. Tiếp tục đến phản ứng liên kết.
Pannel ứng dụng trong chẩn đoán Thalassemia
Tổng quan Thalassemia Giới thiệu Thalassemia Thalassemia (hay còn được gọi với tên bệnh tan máu bẩm sinh) là một bệnh lý huyết học di truyền có tỷ lệ lưu hành cao trên toàn cầu và là một vấn đề…
Ảnh hưởng của TaqMan probe đến độ đặc hiệu và độ nhạy trong Realtime PCR
TaqMan Probe đóng vai trò trung tâm trong việc đảm bảo độ chính xác, độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng trong kỹ thuật Real-time PCR
TAQMAN PROBE VÀ CÁC TIÊU CHÍ QUAN TRỌNG KHI THIẾT KẾ PROBE TRONG REAL TIME PCR
Probe (đầu dò) trong sinh học phân tử là một đoạn oligonucleotide (DNA hoặc RNA sợi đơn) ngắn, được đánh dấu bằng các phân tử phát tín hiệu (thường là các chất phát huỳnh quang). Probe được thiết kế để…
HPLC Là Gì? Ứng Dụng Của HPLC Trong Tinh Sạch và Phân Tích Oligonucleotide
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) – Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật phân tích được sử dụng để tách, định tính hoặc định lượng các chất, thành phần trong một hỗn hợp chất lỏng.
CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH OLIGONUCLEOTIDE
Oligonucleotide là những phân tử DNA hoặc RNA mạch đơn hoặc mạch đôi có kích thước ngắn thường được sử dụng trong các ứng dụng sinh học phân tử, y học và nghiên cứu khoa học. Các trình tự oligonucleotide…
Nguồn tham khảo
- Glen Research. https://www.glenresearch.com/reports/gr5-15
- B.A. Connolly and R. Rider, Nucleic Acids Res., 1985, 13, 4485.
- B.A. Connolly, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 3131-3139.
- N.D. Sinha and R.M. Cook, Nucleic Acids Res., 1988, 16, 2659.
- A. Kumar, S. Advani, H. Dawar, and G.P. Talwar, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4561.
- R. Zuckermann, D. Corey, and P. Schultz, Nucleic Acids Res., 1987, 15, 5305.
- K.C. Gupta, P. Shanna, S. Sathyanarayana, and P. Kumar, Tetrahedron Lett., 1990, 31, 2471-2474.
- U. Asseline, E. Bonfils, R. Kurfurst, M. Chassignol, V. Roig, and N.T. Thuong, Tetrahedron, 1992, 48, 1233-1254.
