Nếu bạn đang làm quen với qPCR và không chắc chắn về reporter nào tương thích với thiết bị qPCR trong phòng thí nghiệm của mình, hoặc đang thiết kế đầu dò cho xét nghiệm của mình và có thắc mắc về các lựa chọn quencher. Bài viết này sẽ cung cấp một số lời khuyên, thông tin về cách chọn reporter và quencher phù hợp cho đầu dò cho xét nghiệm qPCR.
1. Probe (đầu dò) là gì?
Đầu dò (Probe) là các đoạn trình tự DNA hoặc RNA nhỏ, mạch đơn có khả năng bắt cặp, liên kết đặc hiệu với một đoạn trình tự trên DNA hoặc RNA mục tiêu. Hiện nay trên thị trường có nhiều loại đầu dò khác nhau bao gồm: đầu dò Taqman, đầu dò molecular beacons, đầu dò MGB Eclipse, đầu dò hybridization. Trong đó, Taqman là đầu dò được sử dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật qPCR và thường có cấu trúc cơ bản bao gồm một phân tử phát huỳnh quang được gắn ở đầu 5’ được gọi là Reporter; và một phân tử hấp thụ huỳnh quang được gắn ở đầu 3’ được gọi là Quencher (Hình 1).
Khi cấu trúc của đầu dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn thì quencher sẽ luôn hấp thụ tín hiệu huỳnh quang phát ra từ đầu reporter thông qua hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (fluorescent resonance energy transfer) gọi tắt là FRET.
Về mặt lý thuyết thì ở điều kiện bình thường quencher sẽ hấp thụ hết tín hiệu do reporter phát ra, nhưng thực tế mức độ hấp thụ của quencher không thể đạt được 100%. Mức độ hấp thụ của quencher thông thường sẽ bị ảnh hưởng bởi 2 yếu tố chính là bao gồm (1) khoảng cách vật lý giữa reporter và quencher. Quencher càng gần Reporter thì khả năng hấp thụ tín hiệu huỳnh quang của quencher càng cao. (2) là sự tương thích, chồng lấp giữa giữa bước sóng của reporter và quencher. Sư tương thích chồng lấp ở đây được hiểu là bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ của reporter bắt buộc phải nằm trong khoảng bước sóng của quencher đó có thể hấp thụ.
2. Nguyên lý hoạt động của đầu dò trong qPCR
Trong kỹ thuật qPCR, đầu dò Taqman thường được sử dụng cho khuếch đại và phát hiện DNA của tác nhân mục tiêu có trong mẫu cần quan tâm. Cơ chế hoạt động của đầu dò Taqman trong qPCR được trình bày minh hoạ ở Hình 2 như sau: khi trong phản ứng qPCR có sự xuất hiện của trình tự mục tiêu thì dầu dò Taqman sẽ liên kết với trình tự mục tiêu trước primer và ở sau vị trí của primer theo chiều từ 5’ đến 3’. Khi đó enzyme Taq polymerase tiến hành kéo dài primer để tổng hợp nên sợi mới, và đến khi gặp đầu dò Taqman thì Taq polymerase sẽ thể hiện hoạt tính exconuclease từ đó cắt bỏ cấu trúc của đầu dò.
Lúc này, reporter của đầu dò sẽ được giải phóng, tách rời hoàn toàn với quencher. Khi nhận được bước sóng kích thích, các reporter này sẽ phát tín hiệu huỳnh quang để máy real-time PCR ghi nhận do lúc này không còn sự hấp thụ ánh sáng từ quencher. Lượng DNA được khuếch đại càng nhiều, thì tín hiệu huỳnh quang thu được sẽ càng mạnh.
3. Cách chọn reporter và quencher phù hợp
3.1. Chọn reporter
3.1.1. Khả năng tương thích của thiết bị
Như đã trình bày trước đó, reporter là các phân tử gắn vào đầu 5’ của probe khi nhận được nguồn sáng có bước sóng kích thích (Absorption max) phù hợp sẽ phát ra tín hiệu huỳnh quang (Emission max).
Ví dụ: phân tử FAM sẽ phát tín hiệu huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng có bước sóng 495 nm. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại reporter khác nhau. Cho nên khi lựa chọn reporter cho probe cần cân nhắc loại thiết bị, máy qPCR đang sử dụng phải có khả năng phát ra các nguồn sáng kích thích, tương thích với reporter đó. Thông tin chi tiết về bước sóng kích thích, độ dài sóng của huỳnh quang phát ra cho các reporter phổ biến được sử dụng trong qPCR được trình bày chi tiết ở Hình 3.
3.1.2. Chọn reporter cho phản ứng qPCR Multiplex
Đối với các ứng dụng, phản ứng multiplex qPCR yêu cầu mỗi trình tự mục tiêu phải được xác định bằng một reporter cụ thể. Khi đó nên lựa chọn các reporter có các bước sóng kích thích, bước sóng phát tín hiệu huỳnh quang cách xa nhau để tránh có sự nhiễu tín hiệu giữa các reporter này.
Ví dụ: khi multiplex hai tác nhân mục tiêu bạn nên chọn FAM và HEX thay vì chọn FAM và TET.
Một nguyên tắc khác nữa là hãy chọn các reporter có tín hiệu mạnh như kênh màu FAM cho các tác nhân, trình tự mục tiêu có nồng độ thấp, ít hiện diện trong mẫu. Còn các reporter có tín hiệu yếu hơn nên được sử dụng cho các tác nhân, trình tự mục tiêu có nồng độ cao thường xuất hiện trong mẫu.
3.2. Chọn quencher
Quencher là các phân tử có khả năng hấp thụ được ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter khi reporter nhận được ánh sáng kích thích. Nên việc chọn các quencher cần chú ý đến khoảng bước sóng hấp thụ của quencher có tương thích với bước sóng phát huỳnh quang của reporter hay không.
Ví dụ: quencher BHQ1 hấp thụ huỳnh quang trong khoảng 480-580 nm (tối ưu nhất 534 nm) sẽ hấp thụ tín hiệu huỳnh quang của FAM, HEX tốt hơn so với BHQ2 hoặc BHQ3. Chi tiết về lựa chọn quencher nào với reporter nào phù hợp được trình bày ở Hình 4.
Ngoài ra quencher có thể được chia thành 2 loại bao gồm: quencher phát huỳnh quang và quencher phát nhiệt.
Quencher phát huỳnh quang là các quencher khi hấp thụ ánh sáng huỳnh quang từ reporter thì sẽ chuyển năng lượng hấp thụ được thành ánh sáng, do đó quencher này sẽ phát ra huỳnh quang nhưng không đến được CCD hay cảm biến quang vì bị cản lại bởi kính lọc chỉ dành cho ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter. TAMRA là một ví dụ minh họa cho quencher phát huỳnh quang, thường được dùng cho đầu dò sử dụng reporter là FAM.
Nhược điểm của quencher phát huỳnh quang là huỳnh quang phát ra từ quencher có thể trùng với bước sóng kích thích reporter của đầu dò khác.
Quencher phát nhiệt là quencher sẽ chuyển bước sóng hấp thụ được thành nhiệt thay vì ánh sáng. Chính đặc tính này cho nên các quencher phát nhiệt thường được sử dụng trong các phản ứng multiplex qPCR từ đó tránh các tình trạng nhiễu chéo các kênh màu.
Bên cạnh đó, các quencher nhiệt này có khả năng hấp thụ huỳnh quang rất mạnh nên hiện nay các quencher phát nhiệt được sử dụng phổ biến nhất trong các phản ứng qPCR. Một số quencher phát nhiệt phổ biến nhất hiện nay bao gồm các loại chính: DABCYL, BHQ, IBFQ nhưng được sử dụng nhiều nhất là các quencher BHQ.
Tài liệu tham khảo
Johansson, M. K. (2006). Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 335, 17–29. https://doi.org/10.1385/1-59745-069-3:17
Pazdernik, N., & Prediger, E. (2015, April 7). qPCR Probes: Selecting reporter dyes and quenchers. Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/qpcr-probes-selecting-the-best-reporter-dye-and-quencher
Tổng hợp kiến thức chi tiết về kỹ thuật Real-time PCR. (n.d.). ABT BIOLOGICAL SOLUTIONS COMPANY LIMITED. Retrieved March 5, 2024, from https://abtvn.com/real-time-pcr/
