1. Cấu trúc và đặc tính của Locked Nucleic Acid
Locked nucleic acid là một hợp chất có cấu trúc tương tự nucleic acid, trong đó phân tử đường có chứa cầu nối methylene liên kết nguyên tử oxy 2’ và nguyên tử carbon 4’ của vòng đường pentose.
Các LNA này tuân theo quy tắc bắt cặp bổ sung của Watson-Crick khi trộn với các base DNA hoặc RNA trong một oligonucleotide. Khi được tích hợp vào trình tự, LNA hỗ trợ độ ổn định của cấu trúc tốt hơn, dẫn đến tăng nhiệt độ nóng chảy của trình tự (Hình 2). Đối với mỗi base được kết hợp, nhiệt độ nóng chảy của trình tự tăng thêm 2-8oC; bên cạnh đó oligonucleotide LNA có thể được tạo ra ngắn hơn so với oligonucleotide DNA hoặc RNA truyền thống mà vẫn giữ được nhiệt độ nóng chảy cao (hình 3). Chúng còn có đặc tính kháng lại nuclease, và các enzyme mà có thể làm suy giảm trình tự DNA hoặc RNA.
2. Lợi ích và ứng dụng của LNA
2.1. Lợi ích
Do các đặc điểm của nucleotide LNA, nên khi chúng được kết hợp vào oligonucleotide sẽ mang lại một số lợi ích khi so với các nucleotide DNA ở trạng thái tự nhiên, những lợi ích đó bao gồm:
- Tăng nhiệt độ nóng chảy
- Tăng độ nhạy và độ đặc hiệu
- Định lượng gen chính xác hơn và có khả năng phân biệt alen
- Thiết kế dễ dàng và linh hoạt hơn cho các trình tự mục tiêu ngắn hoặc khó thiết kế
2.2. Ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản
2.2.1. Ứng dụng trong nghiên cứu miRNA
miRNA có kích thước rất nhỏ và hàm lượng GC rất khác nhau (5–95%) nên việc phân tích chúng bằng các phương pháp truyền thống trở nên khó khăn. Việc sử dụng các công nghệ dựa trên DNA hoặc RNA để phân tích miRNA có thể gây ra độ không đảm bảo (uncertainty) cao và độ bền thấp, bởi vì Tm của mạch đôi oligonucleotide/miRNA sẽ thay đổi rất nhiều tùy thuộc vào hàm lượng GC của các trình tự. Điều này đặc biệt có vấn đề
trong các ứng dụng như lập hồ sơ microarray và các thí nghiệm thông lượng cao liên quan đến việc phân tích nhiều mục tiêu miRNA trong cùng điều kiện thí nghiệm.
Những thách thức này trong phân tích miRNA có thể được khắc phục bằng cách sử dụng oligonucleotide được tăng cường LNA. Chỉ cần thay đổi hàm lượng, các oligonucleotide có thể được thiết kế với một Tm cụ thể, bất kể hàm lượng GC của miRNA. Hàm lượng LNA có thể chuẩn hóa Tm primer, probe và chất ức chế, nhằm đảm bảo rằng tất cả chúng đều hoạt động tốt trong cùng điều kiện thí nghiệm.
Một thách thức khác khi nghiên cứu miRNA là mức độ tương đồng cao giữa các trình tự. Một số thành viên trong họ miRNA khác nhau chỉ duy nhất một nucleotide. Do đặc điểm có ái lực cao, nên LNA có thể được sử dụng để tăng cường khả năng phân biệt của primer và probe nhằm đảm bảo khả năng phân biệt các trình tự miRNA tương đồng này. Đồng thời, chúng mang lại sự cải thiện đáng kể về độ nhạy và độ đặc hiệu, đảm bảo hiệu suất tối ưu cho tất cả các mục tiêu miRNA.
2.2.2. Ứng dụng trong các nghiên cứu đa hình đơn (SNP)
Độ đặc hiệu cao của đầu dò khiến chúng trở nên lý tưởng cho ứng dụng phát hiện đa hình đơn. Việc sử dụng các LNA vào cái vị trí sai khác, có thể đảm bảo sự phân biệt tuyệt vời giữa các trình tự tương đồng với sự khác biệt chỉ duy nhất một nucleotide. Để sự phân biệt này thành công, cần phải có sự khác biệt rõ ràng về nhiệt độ nóng chảy. Sự khác biệt về nhiệt độ nóng chảy giữa mục tiêu chính xác và mục tiêu không khớp là ΔTm. Việc kết hợp LNA trong oligonucleotide có thể làm tăng ΔTm giữa mục tiêu chính xác và mục tiêu không khớp lên tới 8°C. Sự gia tăng ΔTm cho phép phân biệt tốt hơn giữa các chuỗi có liên quan chặt chẽ với nhau, chẳng hạn như các thành viên của họ miRNA.
2.3. Ứng dụng trong chuẩn đoán phân tử Của LNA
Sự gia tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của oligonucleotide được tăng cường LNA khiến chúng trở nên lý tưởng cho các chuẩn đoán các mẫu khó khăn, đặc biệt đối với các mục tiêu biểu hiện thấp.
Ví dụ, primer PCR tăng cường LNA là tốt hơn để định lượng các RNA ngắn trong một lượng nhỏ sinh thiết lỏng, chẳng hạn như huyết thanh và huyết tương (1), và probe tăng cường LNA mang lại độ nhạy và tỷ lệ tín hiệu tuyệt vời trong các mẫu FFPE.
Pannel ứng dụng trong chẩn đoán Thalassemia
Tổng quan Thalassemia Giới thiệu Thalassemia Thalassemia (hay còn được gọi với tên bệnh tan máu bẩm sinh) là một bệnh lý huyết học di truyền có tỷ lệ lưu hành cao trên toàn cầu và là một vấn đề…
Ảnh hưởng của TaqMan probe đến độ đặc hiệu và độ nhạy trong Realtime PCR
TaqMan Probe đóng vai trò trung tâm trong việc đảm bảo độ chính xác, độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng trong kỹ thuật Real-time PCR
TAQMAN PROBE VÀ CÁC TIÊU CHÍ QUAN TRỌNG KHI THIẾT KẾ PROBE TRONG REAL TIME PCR
Probe (đầu dò) trong sinh học phân tử là một đoạn oligonucleotide (DNA hoặc RNA sợi đơn) ngắn, được đánh dấu bằng các phân tử phát tín hiệu (thường là các chất phát huỳnh quang). Probe được thiết kế để…
HPLC Là Gì? Ứng Dụng Của HPLC Trong Tinh Sạch và Phân Tích Oligonucleotide
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) – Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật phân tích được sử dụng để tách, định tính hoặc định lượng các chất, thành phần trong một hỗn hợp chất lỏng.
CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH OLIGONUCLEOTIDE
Oligonucleotide là những phân tử DNA hoặc RNA mạch đơn hoặc mạch đôi có kích thước ngắn thường được sử dụng trong các ứng dụng sinh học phân tử, y học và nghiên cứu khoa học. Các trình tự oligonucleotide…
Tài liệu tham khảo
- Jensen, S. G., Lamy, P., Rasmussen, M. H., Ostenfeld, M. S., Dyrskjøt, L.,Ørntoft, T. F., & Andersen, C. L. (2011). Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs. BMC genomics, 12(1), 1-12.
- What is LNA and why is it such a powerful research tool. QIAGEN. (n.d.). https://www.qiagen.com/us/knowledge-and-support/knowledge-hub/technology-andresearch/lna-technology/power-of-lna/what-is-lna/lna-powerful-research-tool#What-arelocked-nucleic-acids–LNA–
- Locked nucleic acid. (n.d.). https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/technicalarticle/genomics/pcr/locked-nucleic-acids-faq
- Egli, M., Minasov, G., Teplova, M., Kumar, R., & Wengel, J. (2001). X-ray crystal structure of a locked nucleic acid (LNA) duplex composed of a palindromic 10-mer DNA strand containing one LNA thymine monomerCoordinates and structure factors have been deposited in the Protein Data Bank (pdb code 1i5w). Chemical Communications, (7), 651-652.
- Latorra, D., Arar, K., & Hurley, J. M. (2003). Design considerations and effects of LNA in PCR primers. Molecular and cellular probes, 17(5), 253-259.
- Simeonov, A., & Nikiforov, T. T. (2002). Single nucleotide polymorphism genotyping using short, fluorescently labeled locked nucleic acid (LNA) probes and fluorescence polarization detection. Nucleic acids research, 30(17), e91-e91
